Основы работы с агаром

[GROWER 714]

Основы работы с агаром

автор: (с) abert[at]entheogen.ru
дата: 03-07-2004

Что такое агар и где его достать



Агар (устаревшее название агар-агар) – продукт, получаемый из красных и бурых водорослей (таких как Eucheuma spinosum Ag., E. gelatinae Ag., Gelidium cartilagineum (Grev. и др.) и образующий в водных растворах плотный студень. Представляет собой белый, похожий на муку порошок.

Состоит в основном из полисахаридов. Применяется в составе питательных сред для культивирования бактерий, грибов, водорослей, а также в кондитерской промышленности, при производстве желейного мармелада, желе, пудингов, мясных и рыбных студней, и т.д.

Биологический (лабораторный) агар отличается от пищевого более высоким качеством, стоимость пищевого агара при этом намного ниже. При использовании в домашних условиях, качество агара является не столь значимым, поэтому есть смысл, брать именно агар используемый в кондитерской промышленности.

Пищевой агар разделяется по плотности, например: Агар М 500, Агар G 700, Агар –900, и т.д. Чем больше число в названии, тем большей вязкостью / плотностью будет обладать полученный гель / студень. Пропорционально увеличению плотности, уменьшается расход агара, но при этом увеличивается его цена.

Если плотность агара неизвестна, его расход можно подобрать экспериментальным путем, получив среду напоминающую по консистенции мармелад. Если среда будет слишком мягкая, Вам будет неудобно переносить отрезанные кусочки.

Найти где продается агар, можно на сайте журнала товары и цены, набрав слово "агар" в строке поиска.


Для выращивания мицелия высших базидиомицетов используются различные питательные среды на агаровой основе. В зависимости от выращиваемого вида, а так же от поставленных целей, питательные среды могут различаться по составу, уровню Ph, вязкости и т.д.

Не будем подробно останавливаться на приготовлении сложных агаровых сред, кому интересен этот вопрос, без труда сможет отыскать необходимую информацию в соответствующей литературе. Рассмотрим приготовление двух самых простых, и в тоже время, подходящих для выращивания огромного количества видов грибов, питательных средах - среды на зерновом, и среды на картофельном отваре.

Питательная среда из зернового отвара

Состав: Зерновой отвар* -100 мл**; агар - 1,5 г.***

* Можно использовать отвар, который остается у Вас после приготовления зерна (если Вы используете зерно в качестве субстрата), но только если зерно варилось без добавления Н2О2. В противном случае, агар попросту не застынет.

**Расход среды на одну 100 мм чашку Петри ~ 30-50 мл.

*** При использовании девятисотого агара.

Процедура приготовления

Берем около 100 мл зерна (пшеница, рожь, ячмень, овес и т.д.),



высыпаем в емкость,



заливаем 500 мл воды (используется обычная вода из-под крана),



ставим на газ,



доводим до кипения,



делаем маленький огонек, и варим в течение 30 минут.



За это время часть воды выкипит, а оставшаяся часть окрасится в приятный, темно-коричневый цвет.



Получившийся отвар необходимо профильтровать. В качестве фильтра можно использовать сложенную в несколько слоев марлю, или хлопчатобумажную ткань. Их укладывают в сито или воронку и аккуратно выливают отвар.



Зерно и мелкие частицы, оставшиеся на фильтре выбрасывают.



Если количество отвара получилось меньше, чем Вы рассчитывали, доведите его до нужного объема долив необходимое количество воды (используется обычная вода из-под крана).



Получившийся отвар переливаем в небольшую емкость,



ставим на газ, доводим до кипения и уменьшаем огонь.



Добавляем необходимое количество агара, постепенно* высыпая его в кипящий отвар. *(Если агар высыпать сразу, он слипнется в комок, который будет потом очень нелегко растворить в [еврей]кости).



Размешивая, снова доводим отвар до кипения.



Продолжая постоянно помешивать, добиваемся ПОЛНОГО растворения агара. Как только это произойдет - среда готова.



После приготовления, тут же разливаем готовую среду по чашкам Петри. (Чашки Петри сделаны из закаленного стекла, поэтому они не лопнут.)



Наливать среду, следует слоем 3-5 мм.



После этого накрываем чашки Петри,



и установив их одна на другую в какую-нибудь тарелку или блюдце, (так будет удобнее переносить их с места на место),



ставим в скороварку (или кастрюлю),



и стерилизуем в течение 1 часа.



Питательная среда из картофельного отвара

Состав: Картофельный отвар -100 мл; агар - 1,5 г.

Процедура приготовления

Берем 150 г картофеля,



тщательно отмываем его от земли,



не очищая, нарезаем кубиками ~1х1 см,



высыпаем в емкость,



заливаем 500 мл воды (используется обычная вода из-под крана),



ставим на газ,



доводим до кипения,



делаем маленький огонек, и варим в течение 30 минут.



За это время часть воды выкипит, а оставшаяся часть окрасится в светло-желтый цвет.
Полученный отвар, так же необходимо профильтровать.

http://shroomery.nl/shrooms/images/wwa/8153.jpg

С готовым отваром, поступаем точно так же, как и в предыдущем случае.

http://shroomery.nl/shrooms/images/wwa/8154.jpg

Изготовление инокуляционной петли

Берем самую длинную, какую сможем найти иглу (замечательно подходит "набор игл для шитья кукол"),

http://shroomery.nl/shrooms/images/wwa/5644.jpg

нагреваем докрасна,

http://shroomery.nl/shrooms/images/wwa/5651.jpg

и не очень сильно, расплющиваем молотком 1-2 см ее острия.

http://shroomery.nl/shrooms/images/wwa/5656.jpg

Должно получиться что-то подобное.

http://shroomery.nl/shrooms/images/wwa/5664.jpg

Зажав самый кончик иглы (5-7 мм) в тисках, загибаем его под прямым углом (буквой "Г"),

http://shroomery.nl/shrooms/images/wwa/5666.jpg

и слегка приплющиваем по бокам.*

http://shroomery.nl/shrooms/images/wwa/5671.jpg

*Это делается это для того, чтобы обеспечить лучший контакт инокуляционной петли при соприкосновении с поверхностью.

http://shroomery.nl/shrooms/images/wwa/5673.jpg

Теперь делаем ручку - оборачиваем противоположенный конец иглы изолентой.

http://shroomery.nl/shrooms/images/wwa/5675.jpg

В результате получается вот такая, (очень удобная для работы со спорами) инокуляционная петля.

http://shroomery.nl/shrooms/images/wwa/5682.jpg

Инокуляция


Аккуратно, стараясь не сдвигать крышки, вынимаем чашки Петри из остывшей скороварки, и откачиваем шприцем воду скопившеюся в блюдце.
Конденсат образовавшийся внутри, на крышках чашек Петри, опасности не представляет.

http://shroomery.nl/shrooms/images/wwa/5718.jpg

Работы по проведению инокуляции, должны проводиться в стерильных условиях! Для этого, все необходимые инструменты (инокуляционную петлю, скальпель, вату, спирт, горелку и т.д.), а так же приготовленные чашки Петри, переносят в помещение, которое затем, в течение некоторого времени* обрабатывают бактерицидной лампой.

*(30-60 мин., зависит от площади помещения и мощности лампы.)


Зайдя в помещение, расставляем инструменты так, чтобы нам было удобно работать. Протираем спиртом все поверхности.

http://shroomery.nl/shrooms/images/wwa/57221.jpg

Инокуляционную петлю погружаем в спирт,

http://shroomery.nl/shrooms/images/wwa/57231.jpg

и прокаливаем ее докрасна над пламенем горелки.

http://shroomery.nl/shrooms/images/wwa/57251.jpg

Затем снова погружаем в спирт,

http://shroomery.nl/shrooms/images/wwa/57261.jpg

подносим к горелке, и тут же (пока горит спирт) несем петлю к чашке Петри.

http://shroomery.nl/shrooms/images/wwa/5731.jpg

Слегка приоткрыв крышку (не смещая ее в сторону), погружаем инокуляционную петлю в агар*.

*Это делается для того, чтобы инокуляционная петля стала липкой от оставшегося на ней расплавленного агара. (Так же, при этом происходит охлаждение инокуляционной петли до безопасной для спор температуры.)

http://shroomery.nl/shrooms/images/wwa/57321.jpg

Сразу же после этого, слегка приоткрыв пакетик с отпечатком, не касаясь его краев, соскребаем инокуляционной петлей часть спор*.

*Если отпечаток хорошего качества, достаточно едва коснуться петлей, чтобы к ней прилипли тысячи спор. Если отпечаток совсем бледный, можно основательно поскрести острым концом инокуляционной петли по бумаге, чтобы вместе с частичками бумаги наверняка захватить часть спор.

http://shroomery.nl/shrooms/images/wwa/5737.jpg

После этого, сразу же переносим инокуляционную петлю обратно к чашке Петри, и так же, слегка приоткрыв крышку (не смещая ее в сторону), касаемся поверхности агара в нескольких местах.

http://shroomery.nl/shrooms/images/wwa/5741.gif

Если спор было достаточно много, они будут заметны на поверхности агара. Если спор было мало, на агаре останутся только следы от контакта с инокуляционной петлей. В любом случае, споры попали на питательную среду, в благоприятные условия, и через несколько дней должны прорасти.

http://shroomery.nl/shrooms/images/wwa/57441.jpg

Обязательно подписывайте свои чашки Петри (название вида, дату инокуляции и т.д., все, что считаете нужным), иначе потом Вы запутаетесь, что, где растет.

http://shroomery.nl/shrooms/images/wwa/5753.jpg

Теперь, чашки Петри необходимо обернуть пищевой пленкой. Это делается для того, чтобы предотвратить проникновение в них посторонних микроорганизмов.

Накладываем пленку поверх чашки Петри,

http://shroomery.nl/shrooms/images/wwa/57601.jpg

поднимаем чашку Петри, опуская при этом пленку

http://shroomery.nl/shrooms/images/wwa/57611.jpg

и обрезаем ее с небольшим запасом.

http://shroomery.nl/shrooms/images/wwa/5762.jpg

Теперь стягиваем края пленки вниз по всему периметру чашки Петри,

http://shroomery.nl/shrooms/images/wwa/57661.jpg

и закручиваем их (как фантик).

http://shroomery.nl/shrooms/images/wwa/5769.jpg

Закрученные края плотно прижимаем рукой

http://shroomery.nl/shrooms/images/wwa/5771.jpg

и в таком виде, убираем чашки Петри в темное, теплое (23-27С) место, на весь период инкубации.

http://shroomery.nl/shrooms/images/wwa/57731.jpg

Инкубация

Через 3-10 дней (в зависимости от количества и качества спор) споры прорастают - в местах инокуляции появляется белый пух мицелия.*

* Мицелий любого другого цвета, или консистенции, (например пленка, или слизь) является явным признаком заражения и должен быть немедленно удален.

http://shroomery.nl/shrooms/images/wwa/5993.jpg

Через несколько дней, очагов мицелия становится больше, и он продолжает разрастаться.

http://shroomery.nl/shrooms/images/wwa/6096.jpg

Очаги мицелия могут появляться не только в местах, контакта с инокуляционной петлей, но и по всей поверхности агара. Это происходит потому, что пока Вы совершали манипуляции внутри чашки Петри, некоторые споры упали с инокуляционной петли сами по себе, и теперь они проросли. Так же, споры могли переместиться в результате движения [еврей]кости (упавшие капли конденсата).

http://shroomery.nl/shrooms/images/wwa/6097.jpg

Если во время инкубационного периода, заражения среды посторонними микроорганизмами не происходит, через 3-4 недели, мицелий полностью осваивает поверхность агара.

http://shroomery.nl/shrooms/images/wwa/8086.jpg

Хранение культур

После того, как мицелий полностью освоит поверхность агара, чашки Петри убирают на хранение в холодильник. При температуре +3-5С процессы жизнедеятельности мицелия замедляются, и он может сохраняться в таких условиях несколько лет. В течение этого времени мицелий постепенно поедает питательную среду, поэтому, чем толще был ее слой, тем дольше мицелий сможет питаться.

По мере надобности, чашки Петри с мицелием достают из холодильника и отрезают кусочки агара для проведения инокуляции*, или для пересадки культуры на свежую питательную среду.**

*Для проведения инокуляции отрезают небольшой (~ 1х1 см) кусочек агара с мицелием и помещают его в емкость с субстратом. Через несколько дней мицелий перблрается на субстрат и постепенно осваивает его целиком. Фото работ по проведению инокуляции кусочками агара, можно посмотреть в иллюстрированном руководстве по выращиванию грибов.

Поскольку для проведения одной инокуляции, достаточно малюсенького кусочка агара, одной 100 мм чашки Петри, хватает на проведение 20-30 инокуляций.

**Такой метод хранения, называется "метод вегетативных пассажей", он позволяет сохранять полученную культуру практически в неизмененном виде. Чем реже происходит пересев, тем меньше клеточных делений претерпевает культура и тем ближе она по своим свойствам к исходному изолянту. Пересадку мицелия на новую среду, в этом случае, рекомендуется проводить не чаще одного раза в год.

Для длительного хранения культур, удобно использовать пробирки со скошенным агаром. Готовую среду разливают по пробиркам, закрывают их ватно-марлевой пробкой, и после стерилизации, пока агар не застыл, устанавливают в наклонном положении - скашивают агар. После того как агар застынет, пробирки инокулируют мицелием, до[еврей]аются полного обрастания поверхности агара, и убирают на хранение в холодильник.

Длительность хранения при этом, достигается за счет уменьшении площади роста мицелия и увеличении толщины питательного слоя (по сравнению с чашкой Петри).

Более подробную информацию о методе хранения культур в пробирках на скошенном агаре, а так же о выделении чистой культуры из плодового тела гриба, Вы сможете найти в тексте "Отечественные техники выращивания грибов в домашних условиях".


Выделение чистой культуры*


* Чистая культура - это клетки микроорганизмов одного вида. (В нашем случае, это мицелий культивируемого гриба).


Если во время роста мицелия, произошло заражение среды посторонними микроорганизмами, необходимо как можно быстрее отделить чистый мицелий, от конкурирующей микрофлоры. Это можно сделать двумя способами.


1. Удаление очага заражения

В случае "точечного заражения", (когда очаг заражения небольшой и локализован в одном месте), его проще вырезать и выбросить, оставив не тронутой основную часть мицелия.

http://shroomery.nl/shrooms/images/wwa/8130.jpghttp://shroomery.nl/shrooms/images/wwa/8147.jpg

Работы по выделению чистой культуры, должны проводиться в стерильных условиях!

Берем чашку Петри, в которой произошло заражение,

http://shroomery.nl/shrooms/images/wwa/8168.jpg

входим с ней в стерильное помещение, протираем все поверхности спиртом, погружаем скальпель в спирт, прокаливаем его над пламенем горелки, снова погружаем в спирт, подносим к горелке, и тут же (пока горит спирт), несем его к чашке Петри.*

*Смотри фото аналогичных действий при работе с инокуляционной петлей.

Слегка приоткрыв крышку (не смещая ее в сторону), вырезаем скальпелем кусок агара, с растущей на нем плесенью,

http://shroomery.nl/shrooms/images/wwa/8175.jpg

подцепляем его кончиком скальпеля и удаляем.

http://shroomery.nl/shrooms/images/wwa/8176.jpg

Чашку Петри с удаленным очагом заражения оборачиваем пищевой пленкой и убираем в темное, теплое место, на весь период инкубации.*

*Смотри фото аналогичных действий при проведении инокуляции.

http://shroomery.nl/shrooms/images/wwa/8181.jpg

Если заражения посторонними микроорганизмами не произойдет, через некоторое время (зависит от того, на какой стадии роста мицелия произошло удаление очага заражения), мицелий полностью освоит поверхность агара.


2. Пересадка мицелия

В случае, когда посторонняя микрофлора занимает значительную часть, и вырезать ее не представляется возможным, из зараженной чашки Петри извлекают кусочек агара с чистым мицелием, и пересаживают его на новую среду в другую чашку Петри.

http://shroomery.nl/shrooms/images/wwa/8135.jpg

Берем чашку Петри, в которой произошло заражение, входим с ней в стерильное помещение, протираем все поверхности спиртом, погружаем скальпель в спирт, прокаливаем его над пламенем горелки, снова погружаем в спирт, подносим к горелке и тут же (пока горит спирт) несем его к чашке Петри.*

*Смотри фото аналогичных действий при работе с инокуляционной петлей.

Слегка приоткрыв крышку (не смещая ее в сторону), вырезаем скальпелем кусочек агара с чистым мицелием,

http://shroomery.nl/shrooms/images/wwa/8138.jpg

подцепляем его кончиком скальпеля

http://shroomery.nl/shrooms/images/wwa/8140.jpg

и переносим на новую среду, в другую чашку Петри.

http://shroomery.nl/shrooms/images/wwa/8142.jpg

Чашку Петри накрываем, подписываем, оборачиваем пищевой пленкой и убираем в темное, теплое место на весь период инкубации.*

*Смотри фото аналогичных действий при проведения инокуляции.

http://shroomery.nl/shrooms/images/wwa/8144.jpg

Через несколько дней, пересаженный кусочек опушится мицелием, а еще через несколько дней мицелий переберется на новую среду. Если заражения посторонними микроорганизмами не произойдет, через 3-4 недели, мицелий полностью освоит поверхность агара.

Взято с Entheogen.ru